近日，再生医学网小编读到一篇关于牙髓血管再生的好文章，作者是山东大学口腔医学院牙体牙髓科韩琦、王效英。特和大家进行分享交流。

        随着组织工程学及再生医学的发展，牙髓病和根尖周病治疗的研究热点已经从传统的根管治疗转向牙髓组织再生方向。牙髓组织再生主要包括神经再生、血管再生、牙本质再生等。

        牙髓血管在结构上只通过狭窄的根尖孔与根尖周组织相联系且无有效的侧支循环，其特殊的结构特点决定了它在损伤后难以自我恢复。在功能上牙髓血管主要为牙髓组织提供营养、清除废物，牙髓损伤后则会影响正常物质交换，引起一系列牙髓、根尖周病变。所以，如何实现牙髓血管再生是牙髓组织再生中非常关键的一步。现有的研究证实牙髓血管再生比较复杂，它需要一系列的细胞级联活动，这些活动与体内的细胞、血管因子和微环境有极大关联。

牙髓血管再生的相关微环境     

        过去我们把炎症当作是一种不良反应。由龋病、外伤等导致的炎症是引起牙髓炎、牙髓坏死的主要原因。目前在临床治疗过程中，无论是使用大量的冲洗液清理根管还是用牙胶密闭坚实地充填根管，其主要目的都是控制炎症。但是有研究表明我们在临床上所采用的直接盖髓术以及有细胞因子植入根管的牙髓再生实验中，在诱导牙髓愈合过程的一开始都伴随着轻微的炎症反应，也就表明炎症可能是诱导牙髓再生重要的激发因素。在创伤修复的过程中，炎症刺激了牙髓干细胞从受伤部位深处的血管周围迁移到受伤区域，增殖分化成内皮细胞来形成新生血管。血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)和转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)等在损伤后的牙髓细胞和内皮细胞中大量表达，说明炎症可能是促进牙髓血管再生的始动因素之一。从龋坏牙齿中分离出来的牙髓细胞具有干细胞特性，有较强的血管因子表达能力，可将其作为种子细胞应用于牙髓血管再生。这说明炎症环境下的牙髓细胞具有引导血管再生的能力。上述研究表明炎症有利于干细胞迁移分化并且能增强血管生成因子的表达能力，有助于血管再生。

        由于牙齿髓腔特殊的解剖结构特点，血管仅通过一狭窄的根尖孔与根尖周组织相通连。即使是在非病理状态下，根管内氧气压力也低于体外培养细胞所使用的压力。在病理状态下，持续的破坏会导致髓腔血管内压力进一步增高，迫使氧气排出，使血管内环境更加处于一种低氧的状态。基于上述理论基础，一些实验开始尝试在低氧的环境下培养牙髓干细胞和牙周膜干细胞并探索它们的增殖分化能力。牙髓干细胞在低氧条件下培养时展现出更快的增殖速度、更高的血管形成能力和更强的血管因子分泌能力。其中缺氧诱导因子1(hypoxiainduciblefactor-1，Hif-1)在低氧环境培养的牙髓干细胞中快速表达并且能调节多种血管因子相关基因的表达，比如VEGF、血小板源生长因子(plateletderivedgrowthfactor，PDGF)、胎盘生长因子(placentagrowthfactor，PIGF)和血管生成素(angiopoietin，Ang)等，Hif-1也能调节基质细胞衍生因子、磷酸鞘氨醇以及它们的受体。当新血管生成和氧含量恢复正常时，Hif-1表达下降，一系列血管因子表达降低。上述实验表明牙髓干细胞在低氧环境中有更好的血管形成能力，证明低氧环境可能是牙髓血管再生的重要条件之一。

        另外，其它相关微环境如年轻恒牙髓腔更容易诱导牙髓血管再生，有生长因子或趋化因子植入的髓腔更容易引导细胞归巢使牙髓血管再生，激活补体系统可能会影响牙髓血管再生。

　　 DPSCs是牙髓组织再生中重要的细胞来源，它是一种多潜能干细胞，具有多向分化能力。一些报道曾指出DPSCs具有易获得、易储存、死亡率低等优点，所以应用极为广泛。DPSCs通过两种途径来诱导牙髓血管再生，其中一条途径是通过高表达促血管生成因子作用于内皮细胞使其再生血管，另一条途径则是通过DPSCs的多向分化潜能直接分化成血管内皮细胞参与血管形成。实验表明牙髓干细胞分泌的促血管生成因子VEGF、成纤维细胞生长因子2(fibroblastgrowthfactor2，FGF-2)、PDGF、胰岛素样生长因子1(insulinlikegrowthfactor1，IGF-1)、金属基质蛋白酶9(matrixmetalloprotein9，MMP-9)和TGF-β都能够促进内皮细胞的增殖和迁移，并通过磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3kinase，PI3K)/蛋白激酶B(proteinkinaseB，PKB)和丝裂原激活蛋白激酶的激酶(mitogen-activatedproteinkinasekinase，MEK)/细胞外信号调节激酶(extra-cellularsingnal-regulatedkinase，ERK)信号通路来实现调控作用。 人牙髓干细胞在内皮细胞分化培养基中培养后，可表达内皮细胞表面标记物血小板内皮细胞粘附分子(plateletendothelialcelladhesionmolecule1，PECAM-1/CD31)、内皮因子(endoglin，CD105)、原始造血细胞/造血祖细胞抗原(hematopoieticprogenitorcellantigen，CD34)等，主要形成类似血管周支持样细胞。另外，DPSCs和内皮细胞共培养后可诱导更多成熟的血管形成。以上都说明DPSCs在牙髓血管再生中发挥重要作用。　

　　 SHED是从脱落的乳牙中分离而来的干细胞。它比骨髓间充质干细胞和DPSCs具有更强的细胞增殖分化能力。Bento等证实在体外实验中SHED在内皮细胞生长培养基中能够分化成血管内皮细胞生长因子2(vascularendothelialgrowthfactor2，VEGF2)阳性和CD31阳性的内皮细胞，而且也证实了VEGF/MEK1/ERK信号通路是调节SHED内皮细胞分化的重要通路。目前国外已经建立多家SHED库，国内正在普及，关于SHED的研究越来越多，其优越之处不仅是表现在其更强的多向分化潜能上，而且其在人体免疫调节和促进伤口愈合过程中也发挥重要作用，所以SHED的应用可能会有广阔的前景。

         SCAPs是存在于未发育完全牙根尖部的一种间质干细胞。它具有多向分化潜能，对牙髓再生、牙体组织再生和牙根继续发育起到了重要的作用。在体外研究中，根尖乳头干细胞与脐静脉内皮细胞联合培养比单纯培养脐静脉内皮细胞在血管形成实验中作用更加显著。在体内实验中，将含有SCAPs的羟基磷灰石支架皮下移植到免疫缺陷小鼠体内，8周后可以明显观察到血管形成。目前很多证据表明，来源于牙根尖部的SCAPs可能是更早期的干细胞，对于组织再生来说也许是更好的细胞来源。

         BMSCs具有很强的自我更新和多向分化潜能，在骨髓造血过程中起着不可替代的支持和调控作用。与人牙髓血管再生有关的BMSCs主要来源于颌骨骨髓。牙髓再生实验中，实验组在老鼠尾端注入大鼠BMSCs并在其皮下植入含有基质细胞衍生因子-1(stromalcellderivedfactor1α，SDF-1)胶原海绵的牙根，3周后在牙根内有新生的牙髓组织和血管形成，表明BMSCs可能参与了牙髓组织的再生，并且是通过引导内源性细胞归巢的方式来实现的。

        有学者体外分离了狗的BMSCs并进行一系列研究，发现其具有牙髓再生的潜力，将细胞再植回狗牙根管中，组织切片实验发现有牙髓组织形成，并伴随有少量的血管及神经。这些实验结果表明BMSCs可能在牙髓血管再生中发挥作用。

        PDLSCs具有增殖、自我更新及多向分化潜能，并且来源相对广泛，作为牙周组织再生、牙再生等研究的候选种子细胞受到越来越多的关注。在体外分离正常和炎症环境中的牙周膜干细胞并加入SDF-1α诱导分化，炎症环境中的牙周膜干细胞其血管内皮向分化的趋势和能力增强。这说明PDLSCs具有血管再生的能力。

        在人体发育过程当中还存在一些侧群细胞，其与干细胞具有相似的细胞表型、基因型和表观遗传学特征。并且在单克隆细胞水平上通过体内外实验证实：侧群细胞参与向三个胚层多系统分化，如皮肤、神经、肺、肝脏组织、造血细胞、肌肉细胞、成骨细胞等，实现机体多种组织病变或损伤的再生修复与功能重建。在人牙髓当中也存在一些牙髓侧群细胞(sidepopulationcell，SPcells)，它们在血管再生过程中发挥重要作用。

         将C-X-C家族趋化因子14(C-X-Cchemokineligand-14，CXCL14)和单核细胞趋化蛋白1(monocytechemotacticprotein1，MCP1)与牙髓SP细胞在体外共培养，发现牙髓SP细胞的细胞迁移和血管生成能力增加。然后将牙髓SP细胞进行异位再生实验，研究其在体内牙髓再生的潜力。将细胞与胶原支架结合后植入处理后的猪牙根中形成复合体结构，将复合体结构植入裸鼠皮下，组织学切片观察有血管样组织形成。

        利用流式细胞术分离出犬牙髓SP细胞，为了验证SP细胞对牙髓血管再生的作用，将其移植到狗牙髓损伤模型中，第14天时毛细血管和神经元细胞基本完全再生，并且检测到SP细胞促血管因子的表达。从猪身上分离得到的牙髓SP细胞在小鼠后肢缺血模型中能形成高密度毛细血管。与骨髓来源和脂肪来源的SP细胞相比，牙髓来源的SP细胞能够诱导形成的血管和神经最多。这也表明，牙髓来源的SP细胞具有较高的血管生成、神经再生潜能。上述研究表明在人体当中能够发挥多向分化潜能的不仅仅是干细胞还可以是侧群细胞，这也提示我们在牙髓血管再生过程中也要探索其他细胞的功能，力求实现真正的牙髓再生。

        VEGF是血管内皮细胞特异性因子之一。VEGF被证实对内皮细胞发挥重要作用，能够促进内皮细胞的增殖和迁移。在体内实验中，VEGF的载体支架在体内空根管中促进了新的血管和结缔组织形成，还能诱导其他生长因子在血管形成过程中表达增加。所以VEGF是非常重要的促进牙髓血管再生因子。有研究表明VEGF与相关细胞表面受体结合后，通过Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。

         FGF家族在牙髓组织再生中起了重要的作用。目前大部分研究主要集中在FGF-2的分泌和相关功能上。FGF-2不仅可以由人牙髓干细胞产生还可以由牙髓成纤维细胞分泌，在牙髓组织中含量较高。Takeuchi等证实FGF-2类似于粒细胞集落刺激因子，在血管形成的过程中对细胞的增殖和迁移产生很大影响。FGF-2在体外实验中能够提高内皮细胞的增殖和毛细血管样组织的形成能力。

        PDGF是由血小板释放的生长因子。内皮细胞产生的PDGF能够促进自身的增殖和迁移形成新生血管。Tran-Hung等证实在牙髓受伤后，由内皮细胞产生的PDGF能够募集血管周支持细胞去形成新生血管以及促进这些血管稳定和成熟。综上所述，生长因子在牙髓血管再生中发挥重要作用。

        牙髓血管再生是牙髓组织再生中非常关键的一步，目前将牙髓血管再生的研究热点集中在组织工程学方面。将牙组织来源的干细胞与生物支架材料以及诱导细胞分化的因子进行复合，在体内外均实现了不同程度的牙源性组织再生。值得注意的是，很多基于组织工程原理设计的生物学方法，正在向着临床方向转化，并不断影响和转变着传统的治疗观念和手段。目前临床和实验研究主要可以分成两大类，一类是内源性细胞引导的牙髓血管再生，另一类是外源性细胞引导的牙髓血管再生。

         通过内源性细胞引导的牙髓组织再生可以避免干细胞提取和储存带来的困难，也可以避免相关伦理性的问题。这种让内源性细胞归巢来代替外源性细胞移植的方法是非常有优势的。临床上将狭窄的根尖孔作为通道，使根尖的血液在根管内形成血凝块来实现牙髓血管再生，部分病例中患牙牙根生长、根尖孔封闭以及根管壁增厚并且牙髓活力与对照牙相似。

        在体内实验中为了模拟人牙髓血管再生，将根管治疗后的人牙齿用生长因子处理，植入裸鼠皮下3周后取出，发现管腔内有明显的细胞分化现象以及血管化牙髓样组织形成，该结缔组织与根管内的原生牙本质壁融合，这说明由生长因子诱导的细胞归巢会使牙髓组织再生且能充满整个根管。实验中向鼠尾注射鼠骨髓间充质干细胞并在其皮下植入放有SDF-1支架的牙根，3周后在牙根内有新生的牙髓组织和血管形成，表明BMSCs通过细胞归巢的方法参与再生牙髓组织和血管。

        实验将干细胞因子(stemcellfactor，SCF)与纤维蛋白凝胶支架结合后放入预备好的人空根管当中，将根管放置在大鼠颅顶骨缺损处6周和12周。实验结束组织学分析发现骨髓间充质干细胞向根管内定向迁移、增殖和分化。结果表明，SCF可以加速细胞的归巢和引导BMSCs血管再生作用。 综上所述，要实现内源性细胞引导的牙髓血管再生，我们的重点就是如何实现大量细胞的募集，以及如何使细胞到达合适的位置。对于牙髓腔这一特殊的解剖结构，募集的通道一般是根尖孔，所以大量实验研究都集中在根管内植入生长因子来募集干细胞到根管中实现牙髓血管再生。

        当牙髓缺失较大，内源性细胞引导的细胞归巢不能再生全部牙髓组织时，加入外源性细胞引导牙髓组织再生成为另外一种可选择的治疗方法。这些外源性细胞主要包括与牙髓血管再生有关的多种干细胞如：DPSCs、SHED、SCAPs、BMSCs、PDLSCs等。我们通常采用的方式是将干细胞与血管生长因子共同移植到支架上形成复合体结构，然后将复合体结构应用于体内外实验中。移植带有DPSCs的富血小板蛋白膜于裸鼠皮下和犬齿根管当中，实验结果表明形成富含血管的牙髓样组织。这可能要归功于富血小板蛋白膜缓慢释放生长因子作用于DPSCs，使得生长因子更长时间作用于细胞，发挥更长久的作用。

         有研究为了真正模拟临床牙髓治疗，将DPSCs和载有VEGF的微球支架植入到冠方为MTA封闭的人根管当中形成复合体结构后，将该复合体结构植入裸鼠皮下。9周后组织切片实验发现牙髓组织再生长度接近牙根全长，并且在牙髓组织当中有大量血管生成。一些实验利用SCAPs等种子细胞制作无支架干细胞膜片衍生颗粒，在体外分析其具有强大的细胞分化功能，将这些颗粒放入处理过的人牙本质段中后植入免疫缺陷小鼠体内，6周后在牙本质空间中有新生牙髓组织和血管形成。有实验将在体外分离的狗骨髓间充质干细胞再植回狗牙根管中，组织切片实验发现有牙髓组织形成，并伴随有少量的血管神经。综上所述，无论是内源性细胞还是外源性细胞，都在牙髓血管再生中发挥巨大作用。

        对于牙髓再生来说，血管再生是必不可少的。如何形成大量、有功能、真正意义上的牙髓血管一直是我们所追求的目标。目前国内外学者已经深入研究牙髓血管再生相关的细胞、因子、微环境等。但对血管再生相关机制及各因子细胞间的相互联系尚缺乏深入的探讨。实现牙髓血管再生甚至牙髓再生并最终应用于临床，还需要进一步深入的探索。

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