主要试剂

    1. OptiPrepTM(600g碘克沙醇，ρ=1.32g/ml)；

    2. OptiPrepTM稀释剂(OptiPrepTM diluent，OD)：150mmol/L KCl、30mmol/L MgCl2、120mmol/L三甲基甘氨酸-KOH，pH7.8；

    3. 匀浆介质(HM)：0.25mol/L蔗糖、25mmol/L KCl、5mmol/L MgCl2、20mmol/L三甲基甘氨酸-KOH，pH7.8；按要求向OptiPrepTM稀释剂和匀浆介质中加入蛋白酶抑制剂。

    主要设备

    1. 高转矩桥式电动机(半导体开关控制)；

    2. Potter-Elvehjem匀浆器，20—40ml，孔隙约0.07mm；

    3. 高速离心机，带可容纳15—50ml离心管的吊桶式转子；

    4. 注射器，带金属套管针(内径约0.8mm)；

    5. 尼龙滤网。

    实验材料

    新鲜的小鼠肝脏。

    实验步骤

    1. 制备500g/L碘克沙醇工作液：每5倍体积OptiPrepTM用1倍体积的OptiPrepTM稀释剂来稀释；

    2. 梯度溶液：用匀浆介质(分别为6倍体积加4倍体积和7倍体积加3倍体积)来稀释500g/L碘克沙醇工作液以制备300g/L和350g/L的两种碘克沙醇梯度溶液。保持于冰上。

    3. 切除肝脏并用剪刀剪切成微小碎块；

    4. 将大约一半肝脏转移到Potter-Elvehjem匀浆器的20ml匀浆介质中，并用研杵研磨约8次，在约500r/min转速下旋转以破碎组织；

    5. 对另一半肝脏切碎物重复以上操作；

    6. 用尼龙滤网过滤；

    7. 通过与等体积的500g/L碘克沙醇工作液混合将匀浆液调整到250g/L碘克沙醇；

    8. 将10—15ml匀浆液转移到50ml管中，从300g/L和350g/L的碘克沙醇梯度溶液中各取10ml加到匀浆液之下；

    9. 在100000g下离心20min；

    10. 细胞核在300g/L和350g/L碘克沙醇界面上成带，用注射器和金属套管针吸取细胞核；

    11. 用2倍体积的匀浆介质稀释悬液，在2000g下离心10min沉淀细胞核。

    注意事项

    所有操作在0—4℃下进行。