细胞毒试验实在组织培养中研究淋巴细胞、抗体或抗体依赖性淋巴细胞杀伤靶细胞的一种技术,也是在体外研究特异性细胞免疫比较可靠和灵敏的方法,目前微量细胞毒试验是应用最广的一种方法.

    （一）淋巴细胞对肿瘤细胞的细胞毒试验方法：

    1) 肿瘤细胞培养物制成悬液,并稀释至需要的细胞浓度.

    2) 于微量试验班的小孔内分别接种0.2ml肿瘤细胞（内含5×102）个细胞,37℃培育24h.

    3) 细胞贴壁后,轻轻轻去培养基,加1mlPBS洗涤,轻去洗涤液及未贴壁细胞.

    4) 向小孔分别加入0.2ml不同浓度的淋巴细胞（分别含有5×105个细胞,5×104个细胞,5×103个细胞）,使淋巴细胞与癌细胞之比依次为1000：1、100：1、10：1.

    5) 45min后加0.1ml5%胎牛血清,37℃继续培养2-3天.

    6) 2%台盼蓝染色,翻转微量试验班,计数活存的肿瘤细胞,并设正常人淋巴细胞代替肿瘤患者淋巴细胞作对照,每份需同时做3个复孔,分别检查各孔中存活活细胞数,按下列公式计算细胞毒率,并做t检验.

    （二） 抗体加补体的细胞毒试验方法：

    此法是组织相容性抗原（HLA）检查技术中最常用的一种方法.也称微量淋巴细胞毒试验.人体的组织相容性抗原存在于淋巴细胞膜的表面,从供者与受者的血液分离淋巴细胞作为靶细胞,以各种定型单价抗血清与家兔血清补体作为效应系统.如果淋巴细胞表面具有与抗血清相对应的抗原,则淋巴细胞就会受损伤或致死而被台盼蓝染色.

    1、  材料：

    a.淋巴细胞

    b. 血清.小牛血清（56℃灭活30min）

    c.待测血清.收集多产妇分娩时的胎盘剥离后的血,分出血清,叠氮纳防腐,4℃保存.

    d.已知阳性对照血清.用上海市中心血站制备的马抗人淋巴细胞血清（ALS）,同时做1：3稀释.

    e.补体.新鲜家兔混合血清,分装小试管,保存于-20℃.

    2、  操作步骤：

    a.在塑料试验盒内加入医用液体石蜡油20ml,放进一块52孔微量玻璃试验班,使板沉至盒底.

    b.用0.25ml的微量定量加液器分别加入待测血清和阳性对照血清2-2ul/孔,阴性对照用Hanks液代之.加样针尖应磨平.

    c.用同法每孔内加入待测的淋巴细胞2-3ul,应先加阴性对照和补体对照孔,然后加待测孔,最后加阳性血清对照孔,加后轻摇使其混匀,置室温作用1h.

    d.每孔加入兔补体5-7ul（按加淋巴细胞顺序加入）,置37℃培育45min（或室温作用1h）.

    e.每孔加入2%台盼蓝等渗液3-5ul室温中静置20min,吸去蓝色上清.

    f.普通显微镜检查,记录每孔中死细胞（着色细胞）数.

    死细胞.体积稍大,着蓝色,无折光性.

    活细胞.大小正常,未着色,较透亮.

    判断标准（每次实验,需做3-6个复本）.

    其中着色细胞：《=20%为阴性, 20%--50%为弱阳性, 50%--70%为阳性,  》=70%为强阳性.