1. 细胞标记或动物标记等
进行生物发光实验，首先根据实验内容的不同，用荧光素酶基因标记肿瘤细胞、干细胞、病毒、药物载体或动物，或者用Lux操纵子标记细菌。用荧光素酶基因标记可通过质粒、慢病毒或逆转录病毒等方法进行。
如果进行荧光实验，就用GFP、EGFP或RFP标记肿瘤细胞、干细胞、病毒或动物等，后者用荧光染料（包括量子点）标记需要检测的物质，如抗体，药物载体等。
2. 体外预实验检测
需要检测的细胞、病毒、细菌等标记后，在活体成像前，可以通过多孔板预先检测一下标记是否成功，荧光素酶或荧光蛋白的表达强度等，并据此筛选阳性克隆、绘制标记物的发光梯度曲线等。体外预实验是作为小动物活体成像解决方案中不可缺少的一部分。比如，利用体外预实验初步检测转染荧光素酶的肿瘤细胞发光值，选择转染率相对高且稳定的一批细胞进行体内实验。对于通常进行的细胞检测来说，具体可以通过活体成像仪器检测活细胞的发光强度，也可以通过体外化学发光和荧光检测仪检测细胞裂解液的发光强度。
当用体外化学发光和荧光检测仪时，可以更准确地捕捉到发光值、更稳定的输出发光值。对于生物发光方式而言，实验所需的仪器是微孔板式化学发光检测仪，如Berthold Centro LB 960。对于荧光方式而言，实验所需的仪器是微孔板式荧光检测仪，如Berthold TwinkleTM LB 970。
3. 活体成像
首先麻醉实验动物，可采用异氟烷（isoflurane）或克他命/甲苯噻嗪（ketamine/xylazine）混合液麻醉实验动物。如果采用气体麻醉，可先注射底物。气体麻醉的优点是动物可以很快进入麻醉状态，一旦停止麻醉气体供应，动物会在几分钟内苏醒。
对于生物发光实验来说，接着注射底物荧光素。最佳的检测时间是在注射后15到35分钟之间。但需要注意的是，对于不同的动物模型，发光动力学过程并不完全一致，最好先进行预实验确定何时发光信号最强。
成像，对于生物发光来说，检测时间一般是1分钟到5分钟，如果信号特别弱，也可以延长到10分钟，如果信号特别强，也可在1分钟以内。对于荧光来说，检测时间是1秒以内。为节约时间，检测生物发光，最多可同时检测5只小鼠。对于荧光实验，麻醉好就可以马上检测。由于激发光照射的角度会影响检测的信号值，所以荧光实验建议每次只检测1只动物。
