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人脐血间充质干细胞采集、分离纯化与保存
时间:2019-11-06 11:28:29  作者:微微  来源:《微创美容外科学》
顺产或剖宫手术中,在胎儿娩出后距胎儿5~7cm处对脐带进行双结扎,剪断脐带,消毒断端,穿刺孕妇端其血管抽取脐血,并用肝素20u/ml抗凝。采集的新鲜血液于18℃保存,于12h内完成细胞分离。

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  (1)采集
  顺产或剖宫手术中,在胎儿娩出后距胎儿5~7cm处对脐带进行双结扎,剪断脐带,消毒断端,穿刺孕妇端其血管抽取脐血,并用肝素20u/ml抗凝。采集的新鲜血液于18℃保存,于12h内完成细胞分离。采集的血液采集过程中尽可能多的将脐血留在脐带内,有助于提高hHCB-MSC的培养成功率。单份脐带采集的血量越多,所能获得的hHCB-MSC就越多,培养成功的概率也就越大。在采集过程中应小心操作,避免按压子宫或挤压脐带和胎盘。采集时间的控制:采集时间是指从胎儿娩出获得脐带血开始,到收集相关细胞并培养至培养皿中所用的时间。为了最大限度地保证干细胞活性,采集时间越短培养效果越好,时间至少控制在15h以内。也有学者认为超过6h即会降低hHCB-MSC的活性而增加其培养难度。
  (2)分离纯化
  分离脐带血目前尚无统一的方法,常见的分离方法有以下几种:
  ①密度梯度离心法:将脐血滴加在Ficoll-Hypaque或Perocoll分离液表面进行密度梯度离心分离出血液中的单核细胞。此法简单易行,但操作步骤过多以及必须使用淋巴细胞分离液,有可能增加hHCB-MSC被污染的风险;
  ②贴壁筛选法:利用hHCB-MSC容易在塑料材料上贴壁生长的特性,将其与造血系统细胞及淋巴细胞分离并传代扩增;
  ③流式细胞仪分选法:利用hHCB-MSC大小或细胞表面的特殊标志,采用流式细胞仪对其进行分选,从而获得目标细胞;
  ④免疫磁珠分离法:利用表面覆盖有特异性抗体的磁珠与间充质干细胞结合,再用永久磁铁吸引出间充质干细胞。
  目前常用的分离方式是将密度梯度离心法和贴壁筛选法相结合,先用密度梯度离心法从脐带血中分离出单个核细胞,再利用hHCB-MSC易贴附在塑料材料上生长的特性,用贴壁筛选法将其从造血细胞中分离出来,从而获得纯度较高的MSCs。
  (3)保存
  第六代细胞生长至80%~90%融合时,常规消化、离心,加入含10%二甲基亚砜基础培养基,调整细胞密度为1*109/L进行梯度冻存。首先置-20℃环境中2~3h,再置-70℃过夜,次日投入液氮保存。6个月后取出冻存管,37℃水浴箱中1~2min解冻,加入基础培养基混悬后,离心去除二甲基亚砜,再加入基础培养基,以1*102/L和1*103/L接种至培养皿,置于细胞培养箱中,次日换液,此后3~5d换液一次。
关键字:人脐血间充质干细胞
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