（1）采集

　　顺产或剖宫手术中，在胎儿娩出后距胎儿5~7cm处对脐带进行双结扎，剪断脐带，消毒断端，穿刺孕妇端其血管抽取脐血，并用肝素20u/ml抗凝。采集的新鲜血液于18℃保存，于12h内完成细胞分离。采集的血液采集过程中尽可能多的将脐血留在脐带内，有助于提高hHCB-MSC的培养成功率。单份脐带采集的血量越多，所能获得的hHCB-MSC就越多，培养成功的概率也就越大。在采集过程中应小心操作，避免按压子宫或挤压脐带和胎盘。采集时间的控制：采集时间是指从胎儿娩出获得脐带血开始，到收集相关细胞并培养至培养皿中所用的时间。为了最大限度地保证干细胞活性，采集时间越短培养效果越好，时间至少控制在15h以内。也有学者认为超过6h即会降低hHCB-MSC的活性而增加其培养难度。

　　（2）分离纯化

　　分离脐带血目前尚无统一的方法，常见的分离方法有以下几种：

　　①密度梯度离心法：将脐血滴加在Ficoll-Hypaque或Perocoll分离液表面进行密度梯度离心分离出血液中的单核细胞。此法简单易行，但操作步骤过多以及必须使用淋巴细胞分离液，有可能增加hHCB-MSC被污染的风险；

　　②贴壁筛选法：利用hHCB-MSC容易在塑料材料上贴壁生长的特性，将其与造血系统细胞及淋巴细胞分离并传代扩增；

　　③流式细胞仪分选法：利用hHCB-MSC大小或细胞表面的特殊标志，采用流式细胞仪对其进行分选，从而获得目标细胞；

　　④免疫磁珠分离法：利用表面覆盖有特异性抗体的磁珠与间充质干细胞结合，再用永久磁铁吸引出间充质干细胞。

　　目前常用的分离方式是将密度梯度离心法和贴壁筛选法相结合，先用密度梯度离心法从脐带血中分离出单个核细胞，再利用hHCB-MSC易贴附在塑料材料上生长的特性，用贴壁筛选法将其从造血细胞中分离出来，从而获得纯度较高的MSCs。

　　（3）保存

　　第六代细胞生长至80%~90%融合时，常规消化、离心，加入含10%二甲基亚砜基础培养基，调整细胞密度为1*109/L进行梯度冻存。首先置-20℃环境中2~3h，再置-70℃过夜，次日投入液氮保存。6个月后取出冻存管，37℃水浴箱中1~2min解冻，加入基础培养基混悬后，离心去除二甲基亚砜，再加入基础培养基，以1*102/L和1*103/L接种至培养皿，置于细胞培养箱中，次日换液，此后3~5d换液一次。